La Prima Stanza, denominata “dell’Incendio del Borgo”, fu realizzata all’epoca di Leone X ed è l’ultima che Raffaello poté vedere completata (1514-1517). Il quadro principale raffigura l’incendio della Città Leonina, che fu prodigiosamente spento da Leone IV facendo il segno della croce da una delle finestre del Vaticano. Sullo sfondo si può osservare la facciata della vecchia Fabbrica di San Pietro; nel gruppo a sinistra è raffigurato un episodio di grande effetto e  drammaticità, la fuga di Enea da Troia in fiamme con il vecchio padre Anchise sulle spalle ed il figlioletto Ascanio. Nella parete di sinistra è raffigurata La battaglia di Ostia, ossia la vittoria navale di Leone IV sui Saraceni: nell’846 i Saraceni sbarcarono infatti ad Ostia, giunsero a Roma e saccheggiarono le basiliche di San Pietro e San Paolo, portando via un prezioso bottino; tre anni dopo ritornarono, ma furono respinti in una eroica battaglia navale. Nell'altra parete è raffigurata l' Incoronazione di Carlo Magno.

Nella Seconda Stanza, “della Segnatura”, è la Disputa del Santissimo Sacramento (1509). Il soggetto di questo splendido complesso di affreschi è la Glorificazione del Cattolicesimo.

La struttura iconografica del ciclo, originariamente sede della biblioteca di Giulio II, fu così detta per aver ospitato, poco dopo l'ultimazione degli affreschi di Raffaello, il Tribunale ecclesiastico "de signatura gratiae". L'impianto generale del ciclo mostra chiaramente una origine allegorico-medievale, essendo legato ad una concezione gerarchica del sapere che si rifà alla teoria della "biblioteca ideale" di San Bonaventura. Tale concezione si concretizza nella scelta di una composizione che richiede una lettura dall'alto verso il basso, procedendo cioè da immagini universali e ideali verso una loro particolare manifestazione terrena.

La volta. Attorno ad un ottagono centrale con putti reggenti lo stemma papale, si trovano quattro sezioni (tondi) dedicate a ciascuna delle facoltà dello spirito, rappresentate con allegorie femminili: La Filosofia, la Teologia (incarnazioni del Vero), la Poesia (incarnazione del Bello) e la Giustizia (incarnazione del Bene). Più sotto, agli angoli, entro quattro scomparti rettangolari sono compresi il Motore immobile che regola l'universo (simboleggiante l'Astronomia e da porre in relazione alla Teologia, che è conoscenza delle cause ultime), il Giudizio di Salomone (simboleggiante il Diritto e da porre in relazione con la Giustizia), la Tentazione di Eva (allusiva alla Filosofia, originata dalla perdita della conoscenza originaria), Apollo e Marsia (simboleggianti la Poesia in quanto musicalità e armonia). Gli stessi concetti vengono ripresi ed approfonditi nelle grandi composizioni sulle pareti sottostanti. Alla Filosofia corrisponde l'opera forse più famosa di Raffaello, la Scuola di Atene, alla Teologia la Disputa del Sacramento, alla Poesia il Parnaso ed alla Giustizia le Virtù Cardinali e Teologali e la Legge.

Nella Quarta Stanza, detta “di Costantino”, è raffigurata la vita leggendaria di Costantino; il complesso di affreschi è stato realizzato dagli allievi di Raffaello su cartoni del Maestro. Il primo quadro rappresenta l’Apparizione della Croce con la celebre frase “in hoc signo vinces”; la grande composizione militare della Sconfitta di Massenzio a Ponte Milvio fu realizzata da Giulio Romano subito dopo la morte di Raffaello.

Nel 1514, dopo la morte di Giulio ll, il successore Leone X nominò Raffaello “architetto della fabbrica di San Pietro" e un anno dopo “conservatore delle antichità romane".